Laporan Laboratorium Pemisahan Molekul Protein dengan Medium Agarosa

A.   Pendahuluan

Bioteknologi adalah salah satu cabang ilmu yang melibatkan teknologi untuk meneliti organisme-organisme. Salah satu manfaat dari bioteknologi ini diterapkan pada alat elektroforesis, dimana elektroforesis merupakan suatu alat yang berfungsi untuk memisahkan makromolekul yang memiliki muatan seperti protein, DNA atau RNA dengan menggunakan energi listrik.

Setiap molekul bermuatan memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda-beda. Untuk mengetahui perubahan-perubahan molekul bermua-tan tersebut dapat dilakukan teknik elektroforesis, yaitu teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya (bentuk, ukuran dan muatan) dalam medan listrik. Elektroforesis sangat bermanfaat untuk memisahkan protein berdasarkan muatannya, selain itu elektroforesis dapat dimanfaatkan sebagai alat bantu diagnosa penyakit.

Dimana prinsip kerja elektroforesis itu dimulai pada saat makromolekul ditempatkan pada medium bermuatan listrik. Molekul yang bermuatan positif (+) akan bergerak ke kutub negatif (-) sedangkan molekul yang bermuatan (-) akan bergerak ke kutub (+).

Percobaan ini menggunakan teknik elektroforesis dengan media agarosa. Dengan membuat origin (sumuran) pada agarosa yang diletakkan pada kutub (+) atau (-) sesuai dengan muatan molekul yang akan diperiksa.

    Kelebihan menggunakan agarosa adalah:

1.        Mudah didapat dan dibuat

2.      Preparasi gel lebih cepat dilakukan karena pembuatan gel agarosa lebih mudah dan bersifat non toksik

3.        Laju pemisahan lebih cepat sehingga fragmen DNA pun lebih cepat terbentuk

4.      Dapat memisahan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya

5.        Dapat dilakukan pada suhu kamar.

                   Namun kekurangan dari medium agarosa ini yaitu : mudah rusak karena

             merupakan gel yang strukturnya kenyal.

B.   Percobaan

a)    Alat :

1. Elektroforesis chamber

2. Power supply

3. Mikropipet

b) Bahan :

·        Plasma

·        Agarosa

·        Buffer TAE 1x

·        Cooamassie R250 staining solution (0,1% Coomassie Blue R250 (w/w), 30% metanol, 5% asam asetat)

·        Destain solution 1 (30% metanol, 5% asam asetat)

·        Destain solution 2 (7% asam asetat, 5% metanol)

c)    Langkah Kerja

1.        Diletakkan agarosa yang telah dicetak dalam chamber

2.      Dimasukkan buffer TAE 1x pada chamber jangan sampai melebihi jembatan

3.        tempat agarosa diletakkan

4.      Dimasukkan plasma kedalam sumur (origin) dengan berjarak 1 origin kosong dalam agarosa dengan digunakan mikropipet ± 50 µL

5.        Dihubungkan kabel dengan power supply.

Set power supply :

·        Voltase 220 v

·        Arus 90 A

·        Waktu 60 menit

                  6.   Dijalankan power supply

                  7. Setelah 60 menit, dimatikan power supply dan ankat agarosa.

 8. Dimasukkan agarosa dalam larutan Coomassie R250  staining solutin  

     dan diamkan selama 5 menit ( gunakan hand gloves ), lalu angkat

     agarosa dan masukan dalam Destain Solution 1 lalu diamkan selama

     5 menit, kemudian angkat agarosa dan masukan dan Destain

     Solution 2 lalu diamkan selama 5 menit.

9. Diamati dan Identifikasi hasil plasma protein tersebut.

C. Hasil Percobaan

Hasil akhir dari percobaan ini memberikan hasil adanya perubahan yang terjadi pada agarosa . Hasil elektroforesis didapatkan pita-pita atau garis-garis protein yang terpisahkan berdasarkan bentuk, ukuran dan muatan molekulnya. Di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan. Sehingga menimbulkan jarak dengan molekul yang berbeda. Hasil dari percobaan tersebut lebih baik dilihat dengan bantuan sinar UV di ruang gelap, sehingga terlihat lebih jelas.

D. Pembahasan

1.     Pengertian Elektroforesis

Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan untuk penelitian di bidang biologi dan genetika, serta ilmu kedokteran.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.

2.   Media Elektroforesis

Elektroforesis biasanya memerlukan media sebagai tempat ber-migrasinya molekul. Medianya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, cellulose acetate, agar gel, starch gel, starch grain, dan gel poliakrilamid.  Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat, contoh lainnya adalah barbiturate buffer.

3.     Faktor-faktor yang Mempengaruhi Migrasi Molekul

Prinsip elektroforesis adalah bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Beberapa faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:(Soedarmadji, 1996)

a.       Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.

b.       Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi.

c.       Bufer (penyangga)

Berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan.

a.       Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein.

b.       Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

d.       Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.

e.       Kekuatan voltase

Semakin tinggi voltase maka aktivitas molekul meningkat.

f.        Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.

Jika temperature tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

4.   Molekul-molekul Hasil Elektroforesis

a.       Albumin

Albumin terdapat sekitar 55-64% dalam protein setiap 4-5 gm ml darah. Albumin merupakan molekul terkecil dengan berat molekul 69.000-70.000 dalam protein. Sehingga dalam percobaan elektroforesis, albumin merupakan molekul yang paling jauh perpindahannya.

b.       Globulin

·  Alpha Globulins (α-globulins)

Alpha globulins mempunyai berat molekul 150.000-160.000 dan berfungsi mengikat lipid, thyroxin, ceruloplasmin, dan cortisol. Dalam percobaan, alpha globulins ini terletak setelah albumin, karena molekulnya lebih berat dibanding dengan albumin.

·  Beta Globulins (β-globulins)

Beta globulins mempunyai berat molekul 160.000-200.000 dan berperan dalam fungsi utama protein plasma dan mengikat zat besi dan kolesterol. Dalam percobaan, beta globulins ini terletak setelah alpha globulins, karena molekulnya lebih berat dibanding dengan alpha globulins.

·  Gamma Globulins (γ-globulins)

Gamma globulins mempunyai berat molekul 150.000-900.000 dan berperan sebagai imun, sehingga disebut juga immunoglobulins (Ig) atau antibody. Dalam percobaan, gamma globulins ini terletak setelah  beta globulins, karena molekulnya lebih berat dibanding dengan beta globulins dan merupakan molekul terberat, sehingga membuat gamma globulin mengalami perpindahan yang paling dekat.

E. Kesimpulan dan Saran

    1. Kesimpulan

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Namun, untuk separasi protein dan asam nukleat dibutuhkan penyangga seperti barbiturate buffer untuk mencegah difusi akibat panas yang dihasilkan arus listrik. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.

2. Saran

Saran pada praktikum kali ini adalah sebaiknya praktikum dilakukan oleh praktikan sendiri dan dilakukan proses elektroforesis yang sebenarnya sejak awal hingga didapatkan hasil yang nyata supaya praktikan lebih mengetahui cara menggunakan metode elektroforesis.

DAFTAR PUSTAKA

Sudarmadji, S. 1996. Teknik Analisa Biokimiawi,edisi pertama. Yogyakarta: Liberty.

Muray, K. Robert, et al., eds. 1999. a LANGE medical book Harper’s Biochemistry, 25^th ed. USA: Lange.

Klippel, John H., et al., eds. 2008. Primer on the Rheumatic Diseases. New York: Springer and Arthritis Foundation.

Ruddy, Shaun, et al., eds. 2001. Kelley’s textbook of Rheumatologi, 6^th ed. Philadelphia: Saunders.